基本介紹

先將生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關系。

操作步驟

1. 配制瓊脂糖EB凝膠，電泳以分離DNA片段。任何類型或等級的瓊脂糖都可以使用。

我們強烈的推薦使用新鮮的TAE/TBE電泳緩沖液。不要重復使用電泳緩沖液，舊的電泳緩沖液PH會增加而降低DNA的回收產量；

2. 電泳足夠時間后，在紫外燈下小心地把所需的DNA的片段切下來。并盡量去除多余的凝膠。

注意：DNA在紫外燈下的曝光的時間不要超過30秒，同時在紫外燈下操作的時候一定要戴保護眼鏡。

3. 稱取空離心管的重量，切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量，求出凝膠塊的重量，近似地確定其體積。一般情況下，凝膠的密度為1g/ml，于是凝膠的體積與重量的關系可按下面換算：凝膠薄片的重量為0.2g 則其體積為0.2ml；加入等倍凝膠體積的Binding Buffer，把混合物置于55℃~65℃水浴中溫浴7min至凝膠完全融化，其間每隔2-3分鐘混勻一次；

重要提醒：在凝膠完全溶解之后，注意凝膠-Binding Buffer混合物的pH值。如果其pH值大于8的話，DNA的產量將大大減少。觀察混合物的顏色，如果是橙色或紅色，則要加入5μl 濃度為5 M，pH為5.2的醋酸鈉，以調低其pH值。經過這一調節(jié)，該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色。一般情況下，使用新鮮的電泳緩沖液，凝膠－Binding buffer混合物的PH值的不會升高；

4. 轉移700μl的DNA-瓊脂糖溶液到一個HiBindTM DNA柱子，并把柱子裝在一個干凈的2ml收集管內，室溫下，10,000×g離心1min，棄去液體。

一個HiBind DNA柱子最多可容納700μl的溶液，如果DNA-瓊脂糖混合物的體積大于700μl，可先轉移700μl溶液至柱子，離心完后，將余下的溶液繼續(xù)加上柱子上。但是每一個HiBindTM柱子最多可以結合25~30μg DNA。如果預期產量較大，則把樣品分別加到合適數目的柱中。

5. 將柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中；室溫下，10,000×g離心 1分鐘，去棄濾出液；這一步相當關鍵，不要忽略此步。

6. 將柱子重新套回收集管中，加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液；注：SPW Wash buffer在使用前必須按瓶子標鑒要求用無水乙醇進行稀釋。

7. 將柱子重新套回收集管中，重復加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液；

8. 棄去液體，將空柱子重新套回收集管中，10,000×g離心1min以甩干柱基質殘余的液體。

這步可以去除柱子基質上殘余的乙醇，不要省略此步―――對得到好的DNA產量是十分重要的。

9. 把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入30~50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上，10,000×g離心1分鐘，離心管中的溶液就是純化的DNA產物，保存于-20度。

如果再洗脫一次的話可以把殘余的DNA洗脫出來，不過那樣的濃度就會較低。

DNA的產量及質量：

把純化產物的樣品稀釋一定的倍數后，分別在260nm和280nm下測其光吸收值，回收得到的DNA的濃度可按以下公式來計算： DNA濃度=光吸收260×50×稀釋倍數μg/ml

長度大于500bp的片段通常能純化得到80%的產量。而50bp~500bp的帶則可達到55%~80%的回收率。(光吸收260/光吸收280)的比率是核酸純度的一個標記。如果此值1.8，則意味著核酸的純度>90%。另一方面，如果純化產物的產量較低時，可以用瓊脂糖EB電泳估算產物的濃度。